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细胞凋亡

   细胞凋亡实验常用检测方法包括细胞形态学鉴定、线粒体膜电位检测、细胞膜表面磷脂酰丝氨酸(PS)检测以及凋亡分子标记检测。以上方法步骤繁琐，只能观察最终实验结果，那么有什么新方法可以弥补这种不足呢？本文将介绍一种新方法——使用活细胞成像分析系统，置于培养箱内实时动态成像，监测细胞变化情况。我们分析了新方法对比常用方法的优势，同时列举了几篇活细胞成像分析系统应用在细胞凋亡方向的高分文章，新方法获得了科研人员的认可，在细胞凋亡实验中被广泛使用。

         细胞死亡是最重要的生物进程之一。当机体存在衰老或损伤细胞需要清除，细胞死亡便作为第一步发挥作用。根据机制不同，细胞死亡可分为细胞凋亡(Apoptosis)、自噬、坏死或坏死性凋亡。细胞凋亡，或者说程序性细胞死亡(Programmed cell death)，刺激因素多源自细胞内部。凋亡过程中细胞形态发生变化(图1)，在细胞凋亡早期，细胞体积缩小，细胞膜脱落，染色质凝聚，细胞器解体。在细胞凋亡晚期，细胞膜破裂，细胞产生毒性物质等，形成凋亡小体。
图1. 细胞凋亡形态变化图
         细胞凋亡可由内在途径或外在途径诱导(图2)。内在途径起源于线粒体，线粒体通过释放细胞色素C诱导Caspase级联反应。Caspase能够降解胞内蛋白质，最终导致细胞死亡。外在途径依赖于胞外信号通路，如TNF、FAS。这些分子与TNF受体家族结合，形成死亡诱导信号复合体(DISC)。最后内在和外在途径共同引起蛋白水解酶Caspase-3的激活，导致细胞的死亡。
图2. 细胞凋亡的内在和外在信号通路
[1]
         细胞凋亡在癌症和神经疾病研究领域尤为重要。在几种神经系统疾病中，不必要的神经细胞凋亡会导致生命危险；另一方面，选择性地诱导神经细胞凋亡也是一种有效的疾病治疗方法。了解细胞凋亡背后的机制有助于预防疾病导致的神经元损伤，并能找到更好的抗癌策略。
         目前检测细胞凋亡的方法主要有显微镜观察法、线粒体膜电位检测、细胞膜表面磷脂酰丝氨酸（PS）检测以及凋亡分子标记检测。

                显微镜观察法


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凋亡过程中细胞形态发生变化，可对细胞核进行荧光染色后在荧光显微镜下进行细胞形态观察。

                线粒体膜电位（Δψm）检测


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细胞凋亡过程中涉及线粒体膜电位的变化。跨膜电位下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中早发生的事件，出现在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA 断裂）之前。使用JC-1或TMRM染料，通过流式细胞分析或荧光成像检测线粒体膜电位差。

                细胞膜表面磷脂酰丝氨酸（PS）检测


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Annexin V是膜联蛋白组的一个成员，如果PS翻转到膜的外侧，Annexin V就会与质膜中的PS发生高亲和力结合。将 Annexin V与PI相结合可以确定细胞凋亡所处的阶段。由于PI只能标记染色质膜受损的细胞核，因此只有Annexin V阳性的细胞代表早期凋亡，只有PI阳性的细胞代表坏死，而Annexin V-PI双阳性则是晚期凋亡的标志。

                凋亡分子标记检测


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Caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用，上游的凋亡信号通过切割Caspase-3使其具备酶活性，执行最后的凋亡程序，在凋亡晚期，Caspase-3酶活性降低。实验者可以通过Western blot对Caspase-3进行定量分析，或者借助检测试剂盒测定Caspase-3活性。

         上述常见的细胞凋亡检测方法，需频繁将细胞拿出培养箱，操作繁琐，且只能得到最终实验结果，无法查看细胞凋亡完整过程，且个别试剂会对细胞结构造成影响。耗时、耗力、实验成功率不能保证，最终影响实验效率。

        


       

        那么有什么新工具可以弥补这些不足，助力细胞凋亡实验呢？​

        

         奎克泰生物的JuLI™系列实时活细胞成像分析仪能够放置于培养箱内，对细胞实时观察、拍摄记录生长周期的全过程，在保持细胞生长环境稳定的情况下，同时对细胞计数、拍照，形成视频、融合度、生长曲线，提供细胞凋亡过程视频和量化结果。此外，JuLI™ Stage活细胞成像分析系统具有全自动X-Y-Z轴、三色荧光、自动/手动对焦、Z-Stack、图像拼接等功能，实现细胞凋亡过程中的实时监测和无损成像，通过明场/荧光细胞图像，基于图像分析软件，鉴定细胞形态特征。

可以在细胞培养箱内工作
         研究者可以预先设定好拍摄参数，通过延时摄影监测并评估细胞凋亡情况，提供细胞凋亡量化结果。
特点
方法

显微镜观察法

操作繁琐，实验结果单一

线粒体膜电位检测

需染色，使用流式细胞仪操作复杂

需频繁取出样本观察，影响细胞生长环境

细胞膜表面磷脂酰丝氨酸检测

凋亡分子标记检测

步骤繁琐，实验结果单一

可长期放置于培养箱，保证细胞稳定生长环境，

操作简单，省时省力

新方法-活细胞成像系统

         对比常规细胞凋亡检测方法，活细胞成像分析系统大大缩减了人工操作的繁琐性、提高了实验结果的准确性、成功率，省时省力，为研究人员带来了便利。

         以下来自世界各地知名机构发布的3篇文章，均为使用JuLI™系列活细胞成像分析系统做的细胞凋亡实验：

         1. 来自韩国国立癌症中心免疫治疗科的研究人员在《Nature Communications》发表题为“Desensitized chimeric antigen receptor T cells selectively recognize target cells with enhanced antigen expression”的文章    ，研究人员应用了细胞凋亡试剂盒，使用JuLI™ Stage测定EBV LCLs细胞凋亡动力学。研究表明CD19 CAR T和MVR CAR T细胞逐渐增加了EBV LCLs细胞凋亡比例。每5min拍摄一次DAPI和RFP荧光图像，持续记录90min。
















         2. 来自墨尔本大学Bio21分子科学与生物技术研究所的研究人员在《Cell Reports》发表题为“Huntingtin Inclusions Trigger Cellular Quiescence, Deactivate Apoptosis, and Lead to Delayed Necrosis”的文章    ，研究人员通过GFP-tagged prion domain protein TIA-1和 Httex1(97Q)-Cherry共转染，使用JuLI™ Stage拍摄图像，共记录90min。结果表明在Httex1包涵体形成后，TIA-1进入到Httex1包涵体中。     















         3. 来自匈牙利科学院自然科学研究中心酶学研究所的研究人员在《Molecular Cancer Therapeutics》发表题为“Identification and Validation of Compounds Selectively Killing Resistant Cancer:Delineating Cell Line-Specific Effects from P-Glycoprotein-Induced Toxicity”的文章    ，研究者应用FITC细胞凋亡检测试剂盒，使用JuLI™ Stage实时荧光检测功能拍摄图像，根据图像荧光强度判断细胞凋亡状态。

       












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图4. EBV LCLs细胞凋亡检测结果图
[3]
图5. GFP标记的TIA-1进入Httex1包涵体（红色）结果图
[4]
图6. NSC57969选择性地诱导细胞凋亡结果图

             参考文献

             [1] Tang D, Kang R, Berghe TV, Vandenabeele P, Kroemer G. The molecular machinery of regulated cell death. Cell Res. 2019 May;29(5):347-364.（IF44.1）

             [2] Han C, Sim SJ, Kim SH, Singh R, Hwang S, Kim YI, Park SH, Kim KH, Lee DG, Oh HS, Lee S, Kim YH, Choi BK, Kwon BS. Desensitized chimeric antigen receptor T cells selectively recognize                           target cells with enhanced antigen expression. Nat Commun. 2018 Feb 1;9(1):468.（IF16.5）

             [3] Ramdzan YM, Trubetskov MM, Ormsby AR, Newcombe EA, Sui X, Tobin MJ, Bongiovanni MN, Gras SL, Dewson G, Miller JML, Finkbeiner S, Moily NS, Niclis J, Parish CL, Purcell AW, 

                   Baker MJ, Wilce JA, Waris S, Stojanovski D, Böcking T, Ang CS, Ascher DB, Reid GE, Hatters DM. Huntingtin Inclusions Trigger Cellular Quiescence, Deactivate Apoptosis, and Lead to Delayed                           Necrosis. Cell Rep. 2017 May 2;19(5):919-927. （IF8.8）

             [4] Füredi A, Tóth S, Szebényi K, Pape VF, Türk D, Kucsma N, Cervenak L, Tóvári J, Szakács G. Identification and Validation of Compounds Selectively Killing Resistant Cancer: Delineating Cell 

                   Line-Specific Effects from P-Glycoprotein-Induced Toxicity. Mol Cancer Ther. 2017 Jan;16(1):45-56.（IF5.7）