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类器官疾病模型


        引言​

       

   基于多能干细胞和成体干细胞的器官再现被称为类器官(Organoids)，类器官是具有生理和分层细胞组织的三维(3D)细胞簇，可近似模拟配对人体器官。通过对多细胞通讯、细胞外基质、遗传操作、生长条件和其他因素的深入研究，代表各种器官类型的类器官已经发展起来。随着类器官培养的发展，患者来源的类器官可用于多种临床应用，包括疾病建模、药物筛选、宿主-微生物相互作用和再生疗法。基于慢病毒表达系统和CRISPR/Cas9基因编辑等技术，可以实现类器官疾病建模和靶向基因治疗，患者来源类器官可以实现个性化医疗。本文重点介绍了类器官在疾病模型中的应用及应用中的限制，并提供了一种助力类器官培养与疾病建模的工具——JuLI™ Stage活细胞成像分析系统。


        类器官概述​

       

         类器官(Organoids)指利用成体干细胞(Adult Stem Cells，ASC)或多能干细胞(Pluripotent Stem Cells，PSC)进行体外三维(3D)培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。类器官具有自组织能力，其结构、形态和生理发展不受限制，为人类感染研究提供了新的工具。类器官模型概括了体内组织器官的许多特征，为研究人类呼吸系统、胃肠道和神经元宿主-微生物相互作用等提供了新的平台。

图1. 类器官培养过程，Recent advances in organoid development and applications in disease modeling  

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        干细胞衍生类器官对疾病进行建模​

       

         相对来说，传统的二维模型对全面理解胚胎发育、细胞分化、组织再生和疾病发展等复杂过程仍然有局限性。而类器官由于其自组织能力可以准确地模拟器官的形态，且能更好地模拟器官在体内的结构和功能特异性，在多种领域具有巨大潜力。如通过建立肿瘤类器官进行癌症研究、诱导肠道类器官来模拟人类传染病、遗传性疾病和退行性疾病等。
         类器官主要包括ASCs和iPSCs衍生的类器官，其特征取决于起始细胞类型，ASCs和iPSCs产生的类器官皆遵循不同的发育途径。iPSCs衍生的类器官主要类似于早期胚胎发育，而ASCs衍生的类器官主要由特定的细胞类型组成。由于ASCs衍生的类器官可模拟成体器官稳态，因此它们被广泛用于疾病建模，如癌症和神经退行性疾病；iPSCs衍生的类器官则主要用于了解与发育相关的疾病。

             疾病类型

            1. 传染病


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单细胞培养和动物模型为阐明疾病条件下的宿主-病原体的相互作用提供了基础。这些模型还推动了用于治疗传染病的药物和疫苗的开发。然而复杂的细胞环境以及人类和动物之间免疫系统的固有差异限制了单细胞培养和动物模型的使用，在此基础上，3D类器官培养的进步促进了药物开发，有助于了解传染病和宿主细胞反应。

诱导的人肠道类器官可以模拟其他宿主-微生物与病原体（如幽门螺杆菌和肠道沙门氏菌）的相互作用，同时可以在这些模型上进行抗病毒/细菌治疗测试。呼吸道传染病通过呼吸道上皮进入人体，气道类器官培养可模拟呼吸道上皮，应用于人类呼吸道感染研究，如利用肺类器官研究肺部病毒的感染。大脑类器官的发展对神经系统感染的研究具有重大意义，在脑类器官模型中研究的病毒感染包括西尼罗河病毒 、单纯疱疹病毒 、登革热病毒 、水痘带状疱疹病毒和HIV等，这些大脑类器官模型表现出功能性突触和活跃的神经网络，显示出树突棘的特征，并具有与发育中的脑组织非常相似的转录谱    。

[2]

使用患者细胞来源的肿瘤类器官是体外癌症建模的新领域。肿瘤类器官可以有效地从致瘤细胞、癌细胞系或从肿瘤中提取的细胞中产生，并且具有较高的可扩增性，从而为研究人员提供足够的材料来模拟特定形式甚至罕见类型的癌症，并进行大规模药物开发和筛选。类器官细胞培养的空间和细胞结构方面优于传统的癌症模型，如细胞系或患者来源的异种移植模型。肿瘤类器官充分代表了患者肿瘤中的肿瘤异质性，可用于预测体内药物敏感性和耐药性    。

[3]

            2. 癌症


​

通过类器官模型模拟遗传性疾病，研究尚不清楚的疾病机制。肝脏类器官可用于模拟常染色体显性遗传病ALGS（阿拉杰里综合征），患者特异性 iPSCs衍生的肝脏类器官，可以观察到明显的管状结构，重现ALGS临床表型，更好地用于人类遗传性疾病的研究    。

[4]

            3. 肿瘤微环境


​

肿瘤细胞作为类器官的体外培养通常由模拟肿瘤微环境的上皮细胞和基质胶组成。实体瘤的很大一部分包括肿瘤微环境，涉及肿瘤浸润免疫细胞、脉管系统和肿瘤基质。多项研究证明了肿瘤微环境参与肿瘤生长的机制。然而，肿瘤细胞和肿瘤微环境相互作用的体外模型匮乏，类器官培养的出现为理解癌症中的肿瘤微环境开辟了新的途径。

             类器官模型的局限性

            1. 再现性


​

目前类器官培养无法控制细胞如何自组织生成类器官，如类器官的大小、形状、细胞组成、表型和分子特征等。尽管最近在标准化和更好地控制衍生类器官（如皮质类器官）方面取得了进展，但临床和制药方向需要生产完全一致的类器官以实现质量控制和安全性，当前的培养技术还无法完全做到    。

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            2. 血管生成


​

氧气和营养物质通过血管运输给类器官，从而促进细胞更好地发育成组织样结构，使类器官中的细胞能够像外周细胞一样存活和发挥作用。但是促进类器官中血管生成并非易事，研究肿瘤发生和血管生成的血管化3D癌症模型、生物打印的3D血管化组织模型等已被开发，但该技术仍不成熟，无法在类器官中生成大量血管网络。

            3. 血液灌注和炎症


​

现有的3D类器官疾病模型仍无法捕获体内发生的复杂和动态炎症生态位。血液作为免疫细胞的载体培养基，对人体的炎症反应至关重要。免疫细胞通过化学吸引到达损伤部位，在细胞粘附分子作用下与血管壁相互作用，然后外渗到发炎部位。因此在3D体外模型中模拟炎症，需要先生成血管进行血液灌注。成功建立炎症生态位的3D模型对于研究动脉粥样硬化性血管疾病、炎症性皮肤病、间质性肾炎甚至炎症性肠病具有重要意义。

            4. 类器官模型验证


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在类器官技术出现之前，小鼠模型常常用于疾病建模中。人源化小鼠是啮齿动物，获得方法是将其先天免疫系统移除并通过人造血干细胞移植完全重新填充了人类免疫细胞。这种人源化小鼠模型对于疾病病理学建模特别有用，并允许在与人类生理学相关的体内环境中评估潜在的治疗候选药物，由于存在完整的免疫系统和血液循环，它们为全面研究疾病病理学提供了一个系统的环境。许多研究已经成功地使用人源化啮齿动物来模拟人类疾病为疾病发病机制和免疫学-疾病相互作用组提供了新的见解，但是，研究人员已经开始意识到并报道啮齿动物和人类免疫学之间的明显差异，从而对使用小鼠模型研究人类疾病的相关性提出了质疑。而在3D类器官中对人类疾病的建模可能仍然需要最终使用人源化小鼠模型进行体内验证。

            5. 数据获得


​

类器官培养成本高昂且耗时，在生成和维持、遗传稳定性和临床应用方面的效率各不相同。在数据获得过程中，人工在显微镜下拍摄类器官图像，耗时耗力；频繁拍摄图像过程中会影响类器官培养环境；孔板内各孔的类器官培养情况无法全面呈现；使用显微镜观察类器官获得的数据分析有限。

          JuLI Stage活细胞成像分析系统在类器官中的应用 

                                                               准备实验                                          成像                                        分析类器官

在相关实验条件进行动态成像

将要培养的类器官细胞或

组织接种在孔板中

在分析软件里绘制视频或

其他分析

图2. 类器官实验流程图
         神经类器官为研究神经发育、神经疾病建模、筛选药物和开发基于细胞的治疗方法提供了一个强有力的工具。我们挑选了一篇使用JuLI™ Stage活细胞成像分析系统应用在类器官疾病模型方向的代表性文章，来自中山眼科中心的研究团队在《Science Advances》期刊发表一篇名为 “Generation of self-organized sensory ganglion organoids and retinal ganglion cells from fibroblasts” 的文章    。
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         为研究ABI重编程的神经元是如何组织形成神经节类器官(iSG)的，研究人员将来自CAG-GFP转基因小鼠的胚胎成纤维细胞(MEFs)与ABI慢病毒在12孔板中共孵育10天后，使用JuLI™ Stage活细胞成像分析系统进行延时拍摄，共记录50h，显示由ABI诱导的单个神经元自组织成一个iSG全过程。与MEF相比，重编程的单个神经元看起来更圆、更有神经元特征，并显示出更高的对比度和更亮的GFP荧光。在拍摄记录的50小时中，神经元首先通过迁移形成更小的细胞簇，然后合并成类似感觉神经节(SG)的细胞簇。

  















图3. ABI诱导的单个神经元自组织形成iSG过程

          iSG神经元表现出成熟感觉神经元的生理特征。疼痛感觉神经元表达离子通道Trpv1、Trpm8和Trpa1分别对热、冷和有害的化学物质作出反应。研究者通过钙成像，使用10μM Capsaicin或100μM Menthol来刺激Trpv1和Trpm8，以证实这两种通道在iSG神经元中的功能表达；通过瞬时灌注100mM的KCL来监测细胞的功能活力。使用JuLI™ Stage活细胞成像分析系统进行延时拍摄，记录样本变化过程。结果表明在使用钙指示剂Fluo-8 AM孵育后，几乎所有由ABI诱导的iSG团簇均显示出绿色荧光（图2，L至N）。在所有记录的细胞中，56.8%的细胞对Capsaicin有反应，70.4%的细胞对Menthol有反应（图3，O到U），表明大量iSG神经元表达了具有疼痛感觉神经元特征的离子通道。

  















图4. (L至N)与Fluo-8 AM孵育后，ABI诱导的iSG和相应的荧光信号结果图

        (O至Q)在Ringe(O)、10μM Capsaicin(P)和100mM KCl(Q)中，荧光强度显示的钙离子变化。

        (R)对10μM Menthol和100mM KCl的代表性钙反应。


* 钙反应计算为荧光(∆F)比初始基线荧光(F0)的变化。(S)对10μM Capsaicin和100mM KCl的代表性钙反应。(T和U)散点图显示了单个细胞对Menthol、Capsaicin或KCl的积极反应。


        结论​

       

         类器官在药物筛选、疾病建模、再生医疗等方向具有巨大的潜力，在过去十年类器官技术取得了巨大的进展，并扩展成更复杂的人类疾病模型。尽管存在着许多挑战与局限性，已有的类器官培养方法和实验程序帮助我们更好地开发类器官研究系统，提供对人类疾病所涉及的分子机制的全面和可靠的理解。使用JuLI™ Stage活细胞成像分析系统，适应各种实验目标和类器官细胞，适配从类器官图像采集到数据分析的完整流程，极大地节省人工、时间，提高实验效率，得到丰富的实验数据。

             参考文献

             [1] Ho BX, Pek NMQ, Soh BS. Disease Modeling Using 3D Organoids Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Int J Mol Sci. 2018 Mar 21;19(4):936. （IF 5.6）

             [2] Blutt SE, Estes MK. Organoid Models for Infectious Disease. Annu Rev Med. 2022 Jan 27;73:167-182. （IF 10.5）

             [3] Weeber F, Ooft SN, Dijkstra KK, Voest EE. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chem Biol. 2017 Sep 21;24(9):1092-1100. （IF 8.6）

             [4] Guan Y, Xu D, Garfin PM, Ehmer U, Hurwitz M, Enns G, Michie S, Wu M, Zheng M, Nishimura T, Sage J, Peltz G. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. 

                   JCI Insight. 2023 Oct 23;8(20):e176034. （IF 8.0）

             [5] Huch M, Knoblich JA, Lutolf MP, Martinez-Arias A. The hope and the hype of organoid research. Development. 2017 Mar 15;144(6):938-941.（IF 4.6）

             [6] Xiao D, Deng Q, Guo Y, Huang X, Zou M, Zhong J, Rao P, Xu Z, Liu Y, Hu Y, Shen Y, Jin K, Xiang M. Generation of self-organized sensory ganglion organoids and retinal ganglion cells from                                  fibroblasts. Sci Adv. 2020 May 29;6(22):eaaz5858. （IF 13.6）